胰蛋白酶活力的測定方法還有哪些

胰蛋白酶的水溶液在pH3時最穩(wěn)定，故用鹽酸液（0.001mol/L）配制，在pH7.6-8.8時酶活性最高，故酶解時以磷酸鹽緩沖液（pH7.6）進行控制。至于為什么空白和實驗組在253nm處都顯示over，那就不清楚了。胰蛋白酶專一性地作用于賴氨酸、精氨酸等堿性氨基酸的羧基組成的肽鍵、酰胺鍵及酯鍵，其水解速率：酯鍵＞酰胺鍵＞肽鍵。采用專屬性較高的合成底物：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE），在胰蛋白酶的作用下，底物被水解成苯酰酯-L-精氨酸，在253nm處的吸收度隨酶促反應(yīng)時間遞增。

同位素標記法的實驗介紹

選定放射性標記劑的比活度λqδ的值必須足夠大，以保證實驗所需要的靈敏度，而又要盡可能地小，使得在該實驗條件下輻射自分解可忽略。一般情形是根據(jù)實驗?zāi)康暮蛯嶒炛芷陂L短，來選擇具有合適的衰變方式，輻射類型和半衰期，且放射毒性低的放射性同位素。至今已確定的放射性核素包括天然的58種和人工制造的約1300種，其中大多數(shù)不常能用作放射性標記劑。主要原因是制備困難、半衰期不合適及放射性不足以定量。在任何一種生產(chǎn)方法中，生產(chǎn)步驟很可能包含或多或少的化學(xué)處理，因而標記實驗人員需要了解某個核素及其周圍的那些元素的化學(xué)性質(zhì)，因為它們有可能成為此放射性同位素的雜質(zhì)。

放射性同位素都衰變（經(jīng)過或不經(jīng)過中間狀態(tài)）到處于基態(tài)的子體核素，衰變時伴隨各種形式的能量輻射，如α、β-、β+、γ、X放射等。在選擇標記劑時，標記實驗人員要仔細研究衰變綱圖，根據(jù)實驗條件和計數(shù)條件來決定那一種輻射，在衰變綱變內(nèi)，代表核能級的兩條水平線之間和距離表示能量差，↑或↓表示能級同伴隨原子序數(shù)增或減少的能量，↓表示從激發(fā)態(tài)至基態(tài)的同質(zhì)異能躍遷。一般要選擇最適宜的半衰期τ的放射性同位素，使τ足夠長，從而使衰變校正有意義或干脆不必作衰變校正，同時又要足夠短，能較安全地進行標記實驗，并使得放射性廢物容易處理，在實際工作中，使用的放射性同位素的半衰期應(yīng)該與實驗需要持續(xù)的時間t相適應(yīng)，如對于某個實驗，t/τ=0.04時，應(yīng)所選放射性同位素的衰變校正為3.5%；而t/τ=0.10時，應(yīng)選放射性同位素的衰變校正為6.6%。t/τ=0.15時，應(yīng)選用其衰變校正為10%。

在體外標記條件，一般選用半衰期較長而射線強度適中，既利于探測，又易于防護和保存的放射性標記劑。體內(nèi)標記條件下，若實驗周期短，應(yīng)選用半衰期短，且能放出一定強度r射線物放射性同位素，若實驗周期長，如需要將動物活殺后對組織臟器分別測定的，則應(yīng)選用半衰期較長放射性同位素。此外，根據(jù)實驗?zāi)康膩磉x用定位的或不定位的標記標記劑，例如研究氨基酸的脫羧反應(yīng)，14C應(yīng)標記在羧基上，只有這種定位標記的氨基酸，才能在脫羧后產(chǎn)生14CO2。而有些實驗不要求特定位置標記，只須均勻標記即可。

選擇放射性標記劑還必須同時滿足高化學(xué)純度，高放射性核純度的要求。在標記劑制備期間、貯存期間以用試驗體系中所使用的溶劑、化學(xué)試劑、酶等可能會產(chǎn)生化學(xué)雜質(zhì)、放射化學(xué)雜質(zhì)及輻射自分解引起的放射性雜質(zhì)，這些雜質(zhì)的存在，使得標記實驗中使用的標記劑不“純”，而或多或少影響實驗的結(jié)果，甚至?xí)?dǎo)致錯誤結(jié)論。 氚標記的胸腺嘧啶核苷（3H－TdR）和尿嘧啶核苷（3H－UR）是兩種常用的標記劑，前者有效地結(jié)合到DNA中，后者則摻入到RNA中，它們的輻射分解速度隨比較放射性的增高及保存時間的延長而增加，在不同溫度和不同溶液中的穩(wěn)定性也不同。

經(jīng)保存八年的3H-TdR約有35%輻射分解為3H－胸腺嘧啶，并導(dǎo)致二醇和水合物的形式，在實驗中這雜質(zhì)會很快摻入細胞并與大分子（很可能是蛋白質(zhì)）結(jié)合，而不是與DNA和RNA相結(jié)合，這些雜質(zhì)用DNA酶和RNA酶處理細胞都不除去。3H－TdR和3H－UR貯存在-20℃的冷凍溶液中輻射分離速度要比+2℃增加3－4倍，但低溫度（-140℃）對貯存也有利，在允許對標記實驗人員在選擇保存放射性標記劑時會有所啟發(fā)。 測量方法的選擇取決于射線種類，對于α射線通?？捎昧蚧\晶體、電離室、核乳膠等方法探測；對能量高的β射線可用云母窗計數(shù)管、塑料閃爍晶體及核乳膠測定，對于能量低的β射線可用液體閃爍計數(shù)器測量：對于γ射線則用G-M計數(shù)管，碘化鈉（鉈）閃爍晶體探測。目前大多數(shù)實驗室主要采用晶體閃爍計數(shù)法和液體閃爍計數(shù)法兩種測量方式。

同一臺探測儀器對不同量的標記劑具有不同的最佳工作條件，在實驗準備階段要檢查探測器是否已調(diào)有所用標記同位素的工作條件，否則需要用一定量的標記劑作為放射源（或選用該同位素的標準源），把探測器的最佳工作條件調(diào)整好，并且要保證探測器性能處于穩(wěn)定可靠的狀態(tài)。

探測最佳工作條件的選擇方法：一種是測“坪曲線”，另一種是找最好的品質(zhì)因素。對于光電倍增管，在理論上不存在“坪”（plateau）。但隨著高壓的增加，在一定范圍內(nèi)，脈沖數(shù)變化較小，形成一段坡度較小的電壓脈沖曲線，通常也稱其為坪。測坪曲線的方法：固定放射源，根據(jù)其射線能量的大小，初選 一個廣大器增益（放大倍數(shù)）和甄別器閾值。不斷地改變高壓（由低到高，均勻增加伏度），每改變一次高壓，都測定一次本底和放射源的計數(shù)率，最后作出高壓本底計數(shù)率和高壓放射源計數(shù)曲線。

用同樣的方法，作另一個甄別閾值（放大倍數(shù)不變）下的高壓計數(shù)率曲線，這樣反復(fù)多作幾條曲線。必要時，還可固定甄別閾值，改變放大倍數(shù)，求出高壓計數(shù)率曲線。應(yīng)選擇“坪”比較平坦的曲線工作條件：甄別閾值和放大增益，作為正式測定時間的儀器工作條件，高壓值應(yīng)選擇在該“坪”中點偏向起始段一邊相應(yīng)的高壓值。品質(zhì)因素，又稱為優(yōu)值，是指在一定條件下，要達到合適的統(tǒng)計數(shù)目所需要的時間是儀器的計數(shù)效率E和本底計數(shù)Nb的函數(shù)： 品質(zhì)因素F=E2/Nb它是衡量一臺計數(shù)器性能的指標，儀器的品質(zhì)因素F應(yīng)該越大越好，品質(zhì)因素F越大，表示測量效率E越高而本底Nb越小。

如果某放射性標記的標準源存在來源困難等問題的話，可以用相對品質(zhì)因素f來代替。 相品質(zhì)因素f=ns/nb 式中ns指某種放射性樣品的計數(shù)率。找最好品質(zhì)因素的方法與測坪曲線一樣，作出幾條高壓－F（或f）的關(guān)系曲線，在幾條曲線中選擇峰值最高的曲線。這根曲線的峰值所對應(yīng)的條件：高壓，甄別閾，放大倍數(shù)等，就是該儀器對被測同位素的最佳工作條件。最佳品質(zhì)因素不一定恰好落在“坪”上，有的在“坪”附近，有的卻在“坪”的下端。著眼于把同位素的整個能譜峰都計下來的標記實驗者主張取“坪”所對應(yīng)的工作條件，而著眼于優(yōu)值者，主張取最佳品質(zhì)因素所對應(yīng)的工作條件，也有人折衷。如果某儀器本底很低，光電倍增管噪音很低和能譜分辯高，二者應(yīng)該相差不大。同一臺儀器的最佳工作條件，隨儀器的使用期延長而有所改變，不同的放射性同位素，其最佳工作條件不同。因此核探測儀器的最佳工作條件具有專屬性，并且要經(jīng)常通過選擇其不同時期的最佳工作條件。更不能不問被測同位素的種類，而千篇一律地使用同一個工作條件。

為了達到準確地計數(shù)，可以長時間一次計數(shù)，或短時間多次測量，兩者達到的標準誤基本相同，為避免外界因素的影響，在實際工作中，取短時間多次測量較為合理適用。在測量樣品的放射性時，本底是一個重要影響因素。本底高，則標準誤和標準誤差都增大，尤其在樣品計數(shù)較低時，本底對標準誤和標準誤差的影響就愈大，從而影響實驗結(jié)果的精度，而且為了達到一定的精度，勢別要增加樣品的測量時間。根據(jù)核衰變的統(tǒng)計規(guī)律，在實驗中如果樣品數(shù)量少，選擇tN=1.4tb的比例（式中tN為樣品放射性測量時間，tb為本底測量時間）較為合理；如果樣品數(shù)量較多是一大批樣品，則延長本底測量時間tb，取tb的時間均值，而tN則可相對短，這樣可節(jié)省時間，有利于縮短實驗周期。對于標記實驗設(shè)計來說，樣品中所含放射性強度的要求，是使其放射性計數(shù)率大于或等于本底計數(shù)的10－20倍。